小鼠血小板表面糖蛋白的流式细胞仪分析--制备稀释或洗涤的全血

1. 用肝素化玻璃毛细管（例如，环形帽）从眼眶后神经丛取50 µl血液，放入装有200 µl TBS /肝素（20 U / ml）的1.5 ml管中。
2. 在1 ml的Tyrode缓冲液中稀释，并用于流式细胞仪分析。 
3. 要准备洗涤后的血液，将稀释的血液以900 xg的速度离心5分钟，除去上清液，然后将沉淀重新悬浮在1.25 ml泰罗德的缓冲液中。
4. 在实验开始之前，直接添加1 mM CaCl2。
   

注意：对于凝血酶诱导的血小板活化，必须除去血浆以防止抗凝血酶活性

洗涤后的小鼠血小板的制备

洗涤后的血小板的制备是更耗时的方法，其需要大量的血液，但是产生可以使用数小时的血小板制剂。

1. 从眶后神经丛中收集1.5毫升玻璃毛细管中的0.5毫升至1毫升血液，放入装有200微升TBS /肝素（20 U /毫升）的1.5毫升试管中。
2. 将样品以500 xg离心5分钟，然后将富含血小板的血浆（PRP）转移到新试管中。为使血小板最佳恢复，应采取包括一些红细胞在内的全白相。
3. 将血小板悬浮液以300 xg的速度离心8分钟，然后将没有任何红细胞的PRP转移到新的试管中。
4. 加入0.5 µM前列环素（PGI2），并以1300 xg离心5分钟。
5. 将血小板沉淀重悬于1 ml Tyrode缓冲液中，加入0.02 U / ml腺苷三磷酸酶和0.5 µM前列环素，在37°C孵育5分钟，并在1300 x g离心5分钟。
6. 重复步骤5，将血小板沉淀重悬于0.5 ml泰洛德缓冲液中，加入0.02 U / ml的腺苷三磷酸双磷酸酶，并在37°C孵育30分钟。