免疫组织化学（丙酮固定的冷冻切片）

请注意：不建议对（对）甲醛固定的样品进行免疫染色，因为大多数大鼠抗体在这些条件下在小鼠组织上只会产生较差的结果。
 

1. 将切片中的冷冻组织切片安装在玻片上，并在4°C的冰冷100％丙酮中固定20分钟。在室温下过夜干燥样品。
2. 为了最大程度地减少试剂量，可以用疏水笔在载玻片上的组织部分周围画一个疏水环。在执行以下所有步骤期间，该环绕区域不应变干。因此，建议在潮湿的盒子中进行孵育。
3. 将玻片在PBS中孵育20分钟。
4. 使用过氧化物酶偶联的二抗时，将玻片与0.03％H2O2在室温下孵育10分钟，以抑制内源性过氧化物酶活性。在PBS中冲洗玻片3次，每次洗涤5分钟。
5. 在封闭溶液（使用二抗宿主物种的血清）中于室温孵育载玻片1小时，在PBS中以1:10或1：100稀释。
6. 用封闭溶液中的第一抗体（2-10 µg / ml）盖玻片，并在室温下孵育2小时。
7. 从载玻片上吸干多余的液体，并在PBS中冲洗3次，每次洗涤5分钟。
8. 根据制造商的说明书，用封闭溶液稀释的荧光素或过氧化物酶偶联的二抗（例如，亲和纯化的驴抗大鼠IgG-FITC或-HRP，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）盖玻片。在室温下孵育1小时。
9. 从载玻片上吸干多余的液体，并在PBS中冲洗3次，每次洗涤5分钟。
10. a）荧光染色的样品可以通过荧光显微镜直接分析。
11. b）为了使过氧化物酶标记的结构可视化，用新鲜制备的3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）底物覆盖玻片，并孵育直到在显微镜下可见红色染色为止，时间可在5到30分钟之间变化。在发生橙色背景染色之前，用去离子水冲洗以终止反应。对于复染，将样品与苏木精孵育30-240 s，并用流动的温水冲洗载玻片20分钟。用水性嵌入溶液（例如，Aquatex，Merck）安装切片。

免疫沉淀

缓冲液和试剂

PBS / EDTA：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH2PO4、8.0 mM Na2HPO4 x 2 H2O，pH 7.3；5毫米EDTA

IP缓冲液：40 mM Tris / HCl，0.3 M NaCl，1 mM EDTA，2 mM PMSF，10 µg / ml亮肽素，10 µg / ml抑肽酶，1 µg / ml胃抑素

伊格帕尔（Igepal）：H2Obidest中10％的股票

2x SDS样品缓冲液：10％β-巯基乙醇（用于还原缓冲液），10％Tris缓冲液（1.25 M），20％甘油，4％SDS，0.02％溴酚蓝 

1. 用1毫升PBS / EDTA（5分钟，1300 xg）中的3 x洗涤小鼠血小板或细胞（每次免疫沉淀1000万），然后重悬于IP缓冲液中。
2. 通过在室温下加入1％Igepal裂解血小板15 – 20分钟。
3. 要去除细胞碎片，请以10,000 xg的转速旋转5分钟，然后将上清液转移至新的杯子中。
4. 通过加入20 µl洗涤过的蛋白G琼脂糖（PGA）进行预清洗。在4°C旋转孵育至少3小时。
5. 将样品以3000 x g离心5分钟。将上清液填充到新的试管中，以数据表中给出的浓度添加抗体（通常为2至5 µg / ml），并在30分钟后添加25 µl洗涤过的PGA。在4°C旋转孵育至少2 h，最好过夜。
6. 要洗涤沉淀物，将样品以3000 x g的速度离心1分钟。将1 ml的含1％NP-40的1 x IP缓冲液添加到PGA沉淀中。以3000 x g离心1分钟。
7. 在普通IP缓冲液中洗涤PGA沉淀两次（在3000 xg下1分钟）。
8. 将PGA沉淀重悬于25 µl 1x SDS样品缓冲液中（还原或非还原），煮沸5分钟。然后可以将样品冷冻（-20°C）以备后用，或者可以进行SDS-PAGE和随后的免疫印迹分析。

免疫印迹（Western印迹分析）

缓冲液和试剂

裂解缓冲液：40 mM Tris / HCl，0.3 M NaCl，1 mM EDTA，0.05％NaN3、1％NP-40

PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH2PO4、8.0 mM Na2HPO4 x 2H2O，pH 7.3

PBS-5％牛奶：含有5％脱脂奶粉的PBS

PBS / T：含0.1％Tween 20的PBS

PBS / T-1％牛奶：含有1％脱脂奶粉的PBS / T

所有步骤均可在室温下执行：

1.在裂解缓冲液中制备小鼠血小板或细胞的裂解液，并与（2x）SDS样品缓冲液在95°C孵育5分钟。

2.在相应的数据表中指示的还原或非还原条件下，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，然后将蛋白质转移至PVDF膜上。

3.搅拌下，用PBS-5％乳封闭膜1小时。

4.将膜与2-5 µg / ml一级抗体在PBS / T-1％牛奶中孵育1小时，同时搅拌。

5.用PBS / T冲洗膜两次，然后在PBS / T中冲洗两次，每次30分钟。洗涤程序可以缩短为三个周期，每次10分钟，但这应单独确定。

6.在PBS / T-1％牛奶中与二抗（HRP缀合的抗大鼠Ig，例如来自DAKO，Glostrup，Denmark，＃P0162）一起孵育

搅拌45-60分钟。

7.用PBS / T冲洗膜两次，然后在PBS / T中冲洗两次30分钟。

8.用ECL（增强的化学发光）观察结合的抗体。