使用抗人GPV1抗体抑制血小板聚集的制作方法

本发明涉及心血管疾病的治疗。特别地，本发明涉及治疗心血管疾病的方法，包括将新的抗人糖蛋白vi抗体或其片段连续施用于有此需要的人患者。

发明背景

急性冠状动脉和脑血管事件是目前世界上的主要死亡原因。此外，在急性冠状动脉综合征后的治疗后6个月周期中复发和死亡的全球发生率仍为8-15％。

在具有st段抬高的急性冠状动脉综合征的情况中，采用冠状动脉血管成形术和引入支架的机械治疗对于紧急恢复冠状动脉血流是高度有效的，但不能防止在接下来的6个月内约15％患者的发病率/死亡率。基于长期纤维蛋白溶解药物、抗凝药物和抗聚集药物联合的溶栓治疗给出甚至不太令人欣喜的结果。事实上，尽管血栓症的医学治疗有所改善，但6个月时的发病率/死亡率相似于无st段抬高的急性冠状动脉综合征的观察结果。

对于脑血管缺血事件，由于对大多数患者整体晚的医护以及目前可用的抗血栓症治疗的出血风险，治疗仍是非常有限。

因此临床上仍然需要改善对心血管疾病的治疗，特别是对于与现有分子相比具有改善特征的新分子和用于施用所述分子的特定剂量方案。面临的挑战是获得对病理性血栓症具有优异功效但没有出血风险的分子和给药方案。

为了满足这种要求，靶标在患病血管中发生的血栓症中必须发挥比在为限制健康血管出血所需的生理止血中更大的作用。血小板糖蛋白vi就是这种情况，已经证实其在动物的实验性血栓症(包括中风、血管重塑)中起作用并且证实其在动脉粥样硬化血栓症中至关重要。

与目前在血栓症治疗中使用的并抑制血小板最终活化阶段(即血小板聚集)的αiibβ3整合素拮抗剂以及血小板募集拮抗剂(p2y12adp受体和阿司匹林的抑制剂)相反，gpvi牵涉到血小板栓形成的几个步骤：通过与受损血管壁相互作用的引发；通过初始血小板活化导致次级激动剂(secondaryagonists)的分泌、整合素和血小板促凝血活性的激活的扩张；经由与纤维蛋白相互作用的生长和稳定(mammadova-bachetal.,2015.blood.126(5):683-91)。因此，gpvi拮抗剂不仅可以防止血小板聚集，还可以防止次级激动剂释放以及生长因子和细胞因子分泌，从而导致出现血管损害。最后，gpvi表达被限制于血小板和巨核细胞，并因此代表了抗血栓症治疗的完美特异性靶标。

gpvi拮抗剂因此被开发用于治疗心血管疾病。

wo2001/000810和wo2003/008454均描述了可溶性gpvi重组蛋白，其是gpvi胞外结构域和人igfc结构域之间的融合蛋白。这种可溶性重组gpvi蛋白与血小板gpvi竞争结合胶原蛋白。这种可溶性gpvi蛋白首先在血栓症鼠模型中获得了令人欣喜的结果，但是这些结果未被证实。此外，这种方法涉及结构、功能和药理学缺点。首先，这种化合物是高分子量嵌合蛋白(～160kda)。gpvi-fc靶向在血管损伤部位暴露的胶原蛋白，其量和可接近性是难以预测的，因此，待注射的产品的量对gpvi-fc的使用构成潜在的限制。另一个限制可能是对在融合蛋白上可能暴露的新表位免疫的风险。

本领域还描述了针对人gpvi的中和性单克隆抗体。

例如，ep1224942和ep1228768公开了特异性结合小鼠gpvi的大鼠单克隆抗gpvi抗体jaq1，用于治疗血栓性病症。jaq1抗体诱导小鼠血小板上的gpvi受体不可逆内化。

ep1538165描述了另一种大鼠单克隆抗gpvi抗体(hgp5c4)，发现其fab片段对由胶原蛋白刺激诱导的血小板的主要生理功能具有明显的抑制作用：对胶原蛋白介导的生理活化标记物pac-i和cd62p-选择素的刺激被hgp5c4fab完全阻止，并且hgp5c4fab离体时有效抑制人血小板聚集而没有任何内在活性。然而，5c4是一种大鼠抗体，因此仅具有非常有限的治疗潜力。

wo2005/111083描述了4种小鼠单克隆抗gpvi抗体om1、om2、om3和om4，发现它们在体外抑制gpvi与胶原蛋白的结合、胶原蛋白诱导的分泌和血栓素a2(txa2)的形成，以及静脉内注射到食蟹猴后离体时胶原蛋白诱导的血小板聚集。om4还可以在大鼠血栓症模型中抑制血栓症。

wo2001/000810还描述了命名为8m14.3、3f8.1、9e18.3、3j24.2、6e12.3、1p10.2、4l7.3、7h4.6、9o12.2、7h14.1和9e18.2的各种鼠单克隆抗gpvi抗体以及命名为a9、a10、c9、a4、c10、b4、c3和d11的几种人噬菌体抗体scfv片段。发现这些抗体和scfv片段中的一些抑制gpvi与胶原蛋白的结合，包括抗体9e18.3、7h4.6和9o12.2以及scfv片段a10、a4、c10、b4、c3和d11。此外，发现9o12.2fab片段完全阻断胶原蛋白诱导的血小板聚集和分泌，阻断纤维蛋白诱导的血小板聚集，抑制胶原蛋白刺激的或纤维蛋白刺激的血小板的促凝血活性以及在静态条件下血小板与胶原蛋白或纤维蛋白的粘附，在动脉血流条件下损害血小板粘附和防止血栓形成。

wo2008/049928描述了衍生自9o12.2的scfv片段，其由(gly4ser)3肽连接的9o12.2单克隆抗体的vh和vl结构域构成。

然而，目前已知的抗gpvi抗体均没有显示在体内可有效用于预防和/或治疗心血管疾病。具体而言，已报道的大多数抗gpvi抗体似乎不适合用于开发人类医学用途的抗血栓剂，尤其是由于其动物来源。

具体而言，已报道一些针对人gpvi的人噬菌体抗体scfv是抑制性的，但其亲和力似乎较低。此外，血小板表面上gpvi被二价或多价配体(如9o12.2完整igg)交联导致血小板经由gpvi二聚化以及经由gpvi与低亲和力fc受体(fcγriia)交联而活化。相比之下，单价的9o12.2fab和scfv片段是抑制性的。

然而，这些片段不能用于治疗，因为它们的大小和它们的动物来源使得它们在人类患者中具有免疫原性。而且，scfv片段呈现短的半衰期，这限制了它们的治疗潜力。

因此仍然需要在人体中无免疫原性的中和性gpvi拮抗剂。

us2006/0088531描述了人scfv片段10b12，其与人gpvi结合的kd为约7.9.10-7m。smethurst(smethurstetal.,2004.blood.103(3):903-11)进一步描述了在人gpvi的ig样c2型结构域1(d1)上被10b12结合的表位。这一表位包含人gpvi的残基r58、k61、r66、k79和r80(基于uniprotkb登录号q9hcn6编号)。

o’connor(o'connoretal.,2006.j.biol.chem.281(44):33505-10)还描述了对gpvi具有低亲和力(5.410-7m)的人scfv片段1c3，其既不阻断胶原蛋白诱导的血小板聚集，也不阻断gpvi与胶原蛋白的结合，但其增强了10b12抗体的抑制作用。gpvi中的1c3表位包含氨基酸i168，并且进一步推测这一表位可能包括残基s164和s182之间的区域，该区域是从小鼠到人类均高度保守的区域。

因此，需要与现有技术的拮抗剂相比具有改善的亲和力、功效和半衰期的人源化抗体(即，在人体内无免疫原性的抗体)，作为有效且充分预防和/或治疗人心血管疾病的手段。而且，这些拮抗剂应当优选是易于纯化的。

在本领域中，描述了诱导gpvi耗竭表型的抗gpvi抗体(wo2006/118350、wo2011/073954、ep2363416)。具体而言，wo2006/118350公开了针对所有哺乳动物的抗gpvi抗体。描述了这一抗体结合的gpvi的表位，其对应于gpvi的ig样c2型结构域2的环9和11，分别对应于氨基酸残基136-142和158-162。

然而，gpvi耗竭是不期望的，因为它不能被控制，并且是不可逆的(即由于巨核细胞上的gpvi耗竭，它持续血小板的寿命，或甚至更长时间)。

在治疗中，需要快速、安全且延长(在数小时范围内)的抗血小板作用。因此，应当开发不诱导gpvi耗竭表型并且优选不诱导体内血小板计数降低(即具有可逆效应)的抗体。

申请人开发了与一种抗gpvi抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段与新型的、无记载的构象表位结合。所述抗gpvi抗体对人gpvi具有强亲和力，并且阻断gpvi与其配体(包括胶原蛋白和纤维蛋白)的相互作用，而不会降低体内血小板计数，也不会耗竭体内gpvi。当连续施用至少2小时时，所述抗体(或其片段)表现出延长的体内效应。因此，本发明涉及改进的对人gpvi或其片段具有特异性的人源化中和性抗体。

发明概述

本发明涉及用于治疗有此需要的受试者中gpvi相关病症的与人糖蛋白vi(hgpvi)结合的分离的人源化蛋白质，其中所述分离的人源化蛋白质在至少2小时期间、优选至少4至6小时期间施用于受试者。

在一个实施方案中，注射分离的人源化蛋白质，优选静脉输注。在另一个实施方案中，腹膜内注射分离的人源化蛋白质。

在一个实施方案中，向患者施用剂量范围为约0.5mg/kg至约50mg/kg，优选约1mg/kg至约32mg/kg，更优选约2.5mg/kg至约25mg/kg，甚至更优选约5mg/kg至约15mg/kg，并且仍然更优选约8mg/kg的人源化蛋白质。

在另一个实施方案中，本发明用途的蛋白质的剂量范围为约125mg至约2000mg，优选约250mg至约1000mg或约500mg至约1000mg。

在一个实施方案中，施用第一次大剂量(bolus)，其中优选地，所述第一次大剂量给药包含待施用的分离的人源化蛋白质总剂量的约10至50％，优选约20％，并且其中优选地，所述第一次大剂量在约5至30分钟内，优选约15分钟内施用。

在一个实施方案中，所述蛋白质与构象表位结合，所述构象表位包含：

-至少一个来自hgpvi(seqidno:13)的氨基酸残基114至142的氨

基酸残基或至少一个来自在hgpvi(seqidno:13)的氨基酸残基114

至142上具有至少60％同一性的序列的氨基酸残基；和

-至少一个来自hgpvi(seqidno:13)的氨基酸残基165至187的氨

基酸残基或至少一个来自在hgpvi(seqidno:13)的氨基酸残基165

至187上具有至少60％同一性的序列的氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含至少一个来自hgpvi(seqidno:13)的氨基酸残基121至135的氨基酸残基或至少一个来自在hgpvi(seqidno:13)的氨基酸残基121至135上具有至少60％同一性的序列的氨基酸残基；和至少一个来自hgpvi(seqidno:13)的氨基酸残基169至183的氨基酸残基或至少一个来自在hgpvi(seqidno:13)的氨基酸残基169至183上具有至少60％同一性的序列的氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含至少一个来自hgpvi(seqidno:13)的氨基酸残基121至136的氨基酸残基或至少一个来自在hgpvi(seqidno:13)的氨基酸残基121至136上具有至少60％同一性的序列的氨基酸残基；和至少一个来自hgpvi(seqidno:13)的氨基酸残基169至183的氨基酸残基或至少一个来自在hgpvi(seqidno:13)的氨基酸残基169至183上具有至少60％同一性的序列的氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述蛋白质与hgpvi结合的kd小于15nm，其中所述kd是使用960至1071ru可溶性人gpvi并使用ph7.4pbs作为运行缓冲液通过表面等离振子共振测量的，并且其中所述分离的人源化蛋白质在体内不诱导gpvi耗竭表型。

在一个实施方案中，用于本发明用途的与hgpvi结合的分离的人源化蛋白质是选自由以下组成的组的抗体分子：完整抗体、人源化抗体、单链抗体、fv、fab；或选自由以下组成的组的抗体片段：单抗体、结构域抗体和纳米抗体；或选自由以下组成的组的单体抗体模拟物：亲和体、affilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、darpin、anticalin、avimer、fynomer和versabody，优选单价抗体。

在一个实施方案中，与hgpv结合的分离的抗体分子是如下抗体分子，其中：

-重链的可变区包含以下cdr中的至少一个：

vh-cdr1：gytftsynmh(seqidno:1)；

vh-cdr2：giypgngdtsynqkfqg(seqidno:2)；和

vh-cdr3：gtvvgdwyfdv(seqidno:3)；

或具有与seqidno：1-3具有至少60％同一性的氨基酸序列的任何cdr：和

-轻链的可变区包含以下cdr中的至少一个：

vl-cdr1：rssqslensngntyln(seqidno:4)；

vl-cdr2：rvsnrfs(seqidno:5)；和

vl-cdr3：lqlthvpwt(seqidno:6)；

或具有与seqidno:4-6具有至少60％同一性的氨基酸序列的任何cdr。

在一个实施方案中，重链的可变区包含以下cdr：gytftsynmh(seqidno:1)、giypgngdtsynqkfqg(seqidno:2)和gtvvgdwyfdv(seqidno:3)，及轻链的可变区包含以下cdr：rssqslensngntyln(seqidno:4)、rvsnrfs(seqidno:5)和lqlthvpwt(seqidno:6)，或具有与所述seqidno：1-6具有至少60％同一性的氨基酸序列的任何cdr。

在一个实施方案中，编码重链可变区的氨基酸序列是seqidno:7，编码轻链可变区的氨基酸序列是seqidno:8，或具有与所述seqidno：7或8具有至少60％同一性的氨基酸序列的任何序列。

在一个实施方案中，编码重链可变区的氨基酸序列是seqidno：7，编码轻链可变区的氨基酸序列是seqidno:9，或具有与所述seqidno:7或9具有至少60％同一性的氨基酸序列的任何序列。

在一个实施方案中，所述gpvi相关的病症是选自动脉和静脉血栓症、再狭窄、急性冠状动脉综合征和由动脉粥样硬化引起的脑血管事件的心血管疾病。

在一个实施方案中，所述gpvi相关的病症是选自以下的心血管疾病：动脉和静脉血栓症、再狭窄、急性冠状动脉综合征、由动脉粥样硬化引起的脑血管事件、心肌梗塞、肺栓塞、严重肢体缺血和外周动脉疾病。

发明详述

“糖蛋白vi(gpvi)”是参与血小板-胶原蛋白相互作用的血小板膜糖蛋白。gpvi是在血小板表面上表达的跨膜胶原蛋白受体。在一个实施方案中，人gpvi的氨基酸序列是seqidno:13(登录号：baa89353.1)或与seqidno:13呈现至少约90％同一性、优选与seqidno:13具有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的任何氨基酸序列。

(seqidno:13)

mspsptalfclglclgrvpa(信号肽)

qsgplpkpslqalpsslvplekpvtlrcqgppgvdlyrleklsssryqdqavlfipamkrslagryrcsyqngslwslpsdqlelvatgvfakpslsaqpgpavssggdvtlqcqtrygfdqfalykegdpapyknperwyrasfpiitvtaahsgtyrcysfssrdpylwsapsdplelvvtgtsvtpsrlpteppssvaefseataeltvsftnkvfttetsrsittspkesdspagparqyytkgn(胞外结构域)

lvriclgaviliilagflaedwhsrrkrlrhrgravqrplpplpplpqtrkshggqdggrqdvhsrglcs(跨膜结构域和胞浆结构域)

gpvi的胞外结构域包含通过域间铰链连接的两个ig样c2型结构域(即d1和d2)。在一个实施方案中，d1包含seqidno:13的氨基酸残基21至109。在一个实施方案中，d1和d2之间的域间铰链(hingeinterdomain)包含seqidno:13的氨基酸残基110至113。在一个实施方案中，d2包含seqidno:13的氨基酸残基114至207。

数字前面的“约”意指所述数字的加上或少于10％的值。

“抗体”或“免疫球蛋白”-如本文所用，术语“免疫球蛋白”包括具有两个重链和两个轻链的组合的蛋白质，而无论其是否具有任何相关的特异免疫反应性。“抗体”是指对感兴趣的抗原(例如人gpvi)具有显著的已知特异免疫反应活性的装配体。术语“抗gpvi抗体”在本文中是指对人gpvi蛋白表现出免疫特异性的抗体。如本文其他地方所解释的，针对人gpvi的“特异性”不排除与gpvi的种同源物的交叉反应。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，它们之间具有或不具有链间共价连接。脊椎动物系统中的基础免疫球蛋白结构已经相对得到深入了解。上位术语“免疫球蛋白”包括在生化上可以区分的五种不同类型的抗体。所有五类抗体都在本发明的范围内；以下讨论一般是针对igg类免疫球蛋白分子进行的。关于igg，免疫球蛋白包含分子量为约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽链和分子量为约53,000-70,000道尔顿的两条相同的重链。四条链通过二硫键以“y”构型连接，其中轻链从“y”的口开始并持续穿过可变区而括上重链。抗体的轻链被分类为κ或λ([κ]，[λ])。每个重链类可以与κ或λ轻链结合。一般而言，当免疫球蛋白由杂交瘤细胞、b细胞或基因工程宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价结合，并且两条重链的“尾部”区域通过共价二硫键或非共价键彼此结合。在重链中，氨基酸序列从y构型的叉末端的n末端运行至每条链底部的c末端。本领域技术人员理解，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其中具有一些亚类(例如γ1-γ4)。这条链的性质决定了抗体的“类型”分别为igg、igm、iga、igd或ige。免疫球蛋白亚类(同种型)例如iggl、igg2、igg3、igg4、iga1等被充分表征，并且已知赋予功能特化。鉴于本发明的公开内容，这些类型和同种型中的每一种的修改版本对于本领域技术人员是容易辨别的，并且因此在本发明的范围内。如上文所述，抗体的可变区允许抗体选择性地识别和特异性地结合抗原上的表位。即，抗体的轻链可变结构域(vl结构域)和重链可变结构域(vh结构域)组合以形成界定三维抗原结合位点的可变区。这种四级抗体结构形成在“y”的每个臂末端存在的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由每条vh和vl链上的三个互补决定区(cdr)限定。

“分离的抗体”–如本文所用，“分离的抗体”是已从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染性组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质组分。在优选的实施方案中，将抗体纯化至：(1)如通过lowry法测定的，大于抗体的80、85、90、91、92、93、94、95重量％或更多，并且最优选大于99重量％；(2)通过使用旋杯式序列分析仪足以获得n末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)如在还原性或非还原性条件下使用考马斯蓝或优选银染色通过sds-page显示均质。因为抗体天然环境的至少一种组分将不存在，分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。

“亲和力变体”-如本文所用，术语“亲和力变体”是指与参考抗gpvi抗体相比表现出氨基酸序列的一个或多个变化的变体抗体，其中亲和力变体与参考抗体相比表现出对人gpvi蛋白的亲和力的改变。通常，与参考抗gpvi抗体相比，亲和力变体将表现出改善的对人gpvi的亲和力。这种改善可以是对人gpvi的kd更低，对人gpvi的ka更高，对人gpvi的结合速率(on-rate)更快或对人gpvi的解离速率(off-rate)更慢，或者与非人gpvi同源物的交叉反应性模式改变。与参考抗gpvi抗体相比，亲和力变体通常表现出在氨基酸序列(例如在cdr中)的一个或多个变化。这样的取代可能导致用不同的氨基酸残基置换在cdr中给定位置存在的原始氨基酸，所述不同的氨基酸残基可以是天然存在的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。

“结合位点”-如本文所用，术语“结合位点”包含负责选择性地结合感兴趣的靶抗原(例如人gpvi)的蛋白质的区域。结合结构域或结合区包含至少一个结合位点。示例性结合结构域包括抗体可变结构域。本发明的蛋白质可以包含单个抗原结合位点或多个(例如两个、三个或四个)抗原结合位点。然而，优选地，本发明的蛋白质包含单个抗原结合位点。

“保守氨基酸取代”-如本文所用，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似性质的氨基酸残基置换的那些，使得肽化学领域的技术人员期望多肽的二级结构和亲水性质基本上不变。因此，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员公知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进一步进行氨基酸取代。

例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；和丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守变化的其他氨基酸组包括：(1)丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸；(2)半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸；(3)颉氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；(4)赖氨酸、精氨酸、组氨酸；和(5)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸。本领域已经定义了具有相似侧链的其他氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。在另一个实施方案中，一段氨基酸可以用结构相似的段(string)替换，所述段在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同。

“嵌合”-如本文所用，“嵌合”蛋白质包含与本质上不是天然连接的第二氨基酸序列连接的第一氨基酸序列。所述氨基酸序列通常可以存在于在融合蛋白中将其聚在一起的独立的蛋白质中，或者它们通常可以存在于同一蛋白质中但以新的排列方式置于融合蛋白质中。嵌合蛋白质可以例如通过化学合成或通过产生并翻译其中肽区以期望的关系编码的多核苷酸来产生。

“cdr”-如本文所用，术语“cdr”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽的可变区内都发现的非连续抗原结合位点。根据由kabat(kabatetal.,1991..j..lmmunol.147(5):1709-19)和chotia和lesk(chothiac.和a.m.lesk,1987.j.mol.bioi.196(4):901-17)推导的以下规则来鉴定cdr：

-cdr-l1：

开始-大约残基24；

之前的残基总是cys；

之后的残基总是trp。通常为trp-tyr-gln，但还可以是trp-leu-gln，trp-phe-gln，trp-tyr-leu；

长度为10至17个残基；

-cdr-l2：

开始-在l1结束之后总是16个残基；

之前的残基一般为ile-tyr，还可以是val-tyr、ile-lys、ilephe长度总是为7个残基；

-cdr-l3：

开始-在l2结束之后总是33个残基；

之前的残基总是cys；

之后的残基总是phe-gly-xxx-gly(seqidno:21)；

长度为7至11个残基；

-cdr-h1：

开始-大约残基26(在cys之后总是4个)[chothia/abm定义]

kabat定义以更后面的5个残基开始；

之前的残基总是cys-xxx-xxx-xxx(seqidno:22)；

之后的残基总是trp。通常为trp-val，还可以是trp-ile、trp-ala长度为10至12个残基(abm定义)chothia定义排除最后4个残基；

-cdr-h2：

开始-在cdr-h1结束(kabat/abm定义)之后总是15个残基之前的残基通常为leu-glu-trp-ile-gly(seqidno:23)，但有一些变化；

之后的残基为lys/arg-leu/ile/val/phe/thr/ala-thr/ser/ile/ala长度kabat定义为16至19个氨基酸(abm定义以更早的7个残基结束)；

-cdr-h3：

开始-在cdr-h2结束后总是33个残基(在cys之后总是2个)；

之前的残基总是cys-xxx-xxx(通常为cys-ala-arg)；

之后的残基总是trp-gly-xxx-gly(seqidno:24)；

长度为3至25个残基。

“ch2结构域”-本文所用，术语“ch2结构域”包括通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340的重链分子的区域。ch2结构域是独特的，因为它不与另一个结构域紧密配对。相反，两个n-连接的支链碳水化合物链插入在完整的天然igg分子的两个ch2结构域之间。据推测，碳水化合物可以提供结构域-结构域配对的替代物，并帮助稳定ch2结构域(burton,molec.immunol.22(1985)161-206)。

“来源于”-如本文所用，术语“来源于”指定的蛋白质(例如抗gpvi抗体或其抗原结合片段)是指蛋白质的来源。在一个实施方案中，来源于特定起始蛋白质的蛋白质或氨基酸序列是cdr序列或与其相关的序列。在一个实施方案中，来源于特定起始蛋白质的氨基酸序列是不连续的。例如，在一个实施方案中，一个、两个、三个、四个、五个或六个cdr来源于起始抗体。在一个实施方案中，来源于特定起始蛋白质或氨基酸序列的蛋白质或氨基酸序列具有与起始序列或其区域基本上相同的氨基酸序列，其中该区域由至少3-5个氨基酸、至少5-10个氨基酸、至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸或至少30-50个氨基酸组成，或者在起始序列中具有其起始点(origin)而使本领域普通技术人员可以其他方式识别的氨基酸序列。在一个实施方案中，改变来源于起始抗体的一个或多个cdr序列以产生变体cdr序列，例如亲和力变体，其中变体cdr序列保持gpvi结合活性。