流式细胞术鉴定表面抗原

实验方法

1．用6孔板培养细胞，待细胞生长达到60%-70%，弃掉旧培养基。收集对应细胞培养基到一离心管内备用。

2．用0.25%胰酶消化细胞，至细胞变圆，加入前面收集的细胞培养基，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞，收集到离心管内（注意：悬浮细胞不需要胰酶消化，直接收集到离心管即可）。

3．200g离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

4．小心吸去上清，可以残留约50μl的培养基。

5．加入约1ml预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5ml离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸去上清，可以残留约50μl PBS。

6．轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

7．在每个流式检测管或板式微孔中加入50μl的稀释后的抗体（抗体用Staining Buffer稀释成合适的浓度）；在空白管/孔或同型对照管/孔中加入50μl Staining Buffer。若进行抗体最佳浓度测试，建议范围2-0.03μg/106细胞。

8．在各管/孔中分别加入50μl细胞悬液（约106细胞），并轻轻混匀。

9．避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20min。孵育完成后，加入Staining Buffer（每流式检测管中加2ml，而每微孔中加200μl）。

10．200g 4℃离心5min，并弃去上清，重复洗涤过程3次。100μl PBS重悬细胞后上流式仪检测。